Методы создания рекомбинантных ДНК

Методы создания рекомбинантных ДНК

1. Расщепление ДНК рестриктазами.В качестве мишеней рестриктаз выступают палиндромы из 4-6 пар оснований. Это веб-сайты рестрикции. Одни рестриктазы заносят разрывы по оси симметрии, и образуются «тупые» концы», другие – со сдвигом, образуются «липкие» концы (куски имеют на концах однонитевые взаимно комплементарные участки длиной в 4 нуклеотида). Приобретенные куски употребляют для сотворения рекомбинантных Методы создания рекомбинантных ДНК ДНК.

2. Секвенирование нуклеотидов. Куски ДНК, различающиеся по размеру, отделяют электрофорезом и изучат любой из их раздельно. Строят рестрикционную карту, на которой обозначено положение каждого веб-сайта рестрикции относительно других участков.

3. Конструирование рекомбинантной ДНК. Плазмиды выделяют из E.coli и убирают из их часть кольцевой молекулы ДНК при помощи рестриктаз Методы создания рекомбинантных ДНК. Комплементарные цепи молекулы ДНК разрезаются в различных местах, в итоге образуются «липкие» концы. На куске ДНК, избранном для пересадки, делают «липкие» концы, используя ту же рестриктазу. Если смешать кусок ДНК (ген) и плазмиду, то они соединяются «липкими» концами. Дальше при помощи лигаз вновь получают кольцевую молекулу ДНК, которая вкупе Методы создания рекомбинантных ДНК с плазмидной ДНК содержит ген, избранный для пересадки. Это рекомбинантная ДНК.

Вероятны:

- сшивка по одноименным «липким» концам (рестриктазно-лигазный способ) – комплементарные друг дружке участки имеют тенденцию к ассоциации за счет спаривания оснований; для восстановления разрывов употребляют ДНК-лигазу;

- сшивка по «тупым» концам (коннекторный способ) – тупые концы соединяют ДНК Методы создания рекомбинантных ДНК-лигазой, при всем этом эффективность реакции меньше, чем при сшивке «липкими» концами;

- сшивка фрагментов с разноименными «липкими» концами – используют линкеры, т.е. химически синтезированные олигорибонуклеотиды, представляющие из себя веб-сайты рестрикции либо их комбинацию (есть линкеры «тупой конец – липкий конец»); так получают очень маленькие количества рекомбинантной ДНК.

4. Клонирование (размножение) рекомбинантной Методы создания рекомбинантных ДНК ДНК:

- клонирование ДНК in vivo: к культуре E.coli добавляют рекомбинантные плазмиды, которые врубаются в бактериальные клеточки, и получают рекомбинантные буктерии. Плазмиды в клеточке начинают реплицироваться. При размножении микробов вновь образующиеся бактериальные клеточки тоже содержат эти плазмиды. Из рекомбинантных микробов выделяют клонированные рекомбинантные плазмиды, а из их – исследуемый кусок Методы создания рекомбинантных ДНК ДНК. Так выделяют ген либо хоть какой кусок ДНК в количествах, достаточных для исследовательских целей;

- аплификация (повышение числа копий) ДНК in vitro: в 1985 г. К. Мюллис с сотрудниками разработали способ клонирования последовательностей ДНК in vitro, получивший заглавие полимеразной цепной реакции (ПЦР). К анализируемому эталону ДНК добавляют в излишке два синтетических праймера Методы создания рекомбинантных ДНК. Праймеры нацелены так, чтоб синтез при помощи полимеразы протекал только меж ними. Тем происходит удвоение копий этого участка ДНК. Амплифицированный участок именуют «ампликоном». Амплификация заключается в циклических циклах и является трехступенчатым процессом: 1 – денатурация ДНК при 95 °С; 2 – отжиг праймеров с комплементарными последовательностями (40-60 °С); 3 – достройка полинуклеотидных цепей от Методы создания рекомбинантных ДНК праймеров при помощи ДНК-полимеразы при 70-75 °С. Длительность обозначенного цикла – наименее 3 минут. Т.е., за 2 часа получают около млрд копий определяемой последовательности ДНК.

Применение ПЦРв мед практике – диагностические испытания на генетические и заразные заболевания (а именно, для ранешней диагностики ВИЧ); для анализа личных сперматозоидов и пр.

5. Введение гена в клеточку.

Ген Методы создания рекомбинантных ДНК водят 2-мя методами так, чтоб он не был разрушен клеточными нуклеазами, и встраивался с геномом клеточки.

1 метод. Трансдукция.

Вектор, молекула ДНК либо РНК, состоящая из векторной части (носителя) и клонируемого чужеродного гена. Задачка вектора – донести избранную ДНК в клетку-реципиент и встроить ее в геном. В состав вектора заходит маркерный Методы создания рекомбинантных ДНК ген, позволяющий селектировать модифицированные клеточки. Выделяют 2 группы маркерных генов: селективные гены, отвечающие за устойчивость к лекарствам либо гербицидам; репортерные гены, кодирующие нейтральные для клеток белки, наличие которых в тканях просто тестируется. За способность гена к экспрессии отвечают регуляторные последовательности, которые встраивают в каждую векторную молекулу. Для экспрессии эукариотических генов Методы создания рекомбинантных ДНК в клеточках прокариот необходимо, чтоб гены контролировались прокариотическими регуляторными элементами.

Типы векторов:

- бактериальные плазмиды – более нередко применяемая для клонирования плазмида pBR 322 сотворена на базе плазмид, выделенных из E.coli;

- вирусы – есть вирусы, не ведущие к смерти клеточки, но встраивающиеся в геном клетки-хозяина, и размножающиеся вкупе с ней, или Методы создания рекомбинантных ДНК вызывающие ее неконтролируемый рост (перевоплощение в раковую);

- гибридные векторы – содержат ДНК фага и плазмиды: космиды и фазмиды.

2 метод. Трансформация (прямое введение гена в клеточку):

- трансфекция: ДНК адсорбируется на кристаллах фосфата кальция, которые поглощаются клеточкой методом фагоцитоза;

- микроинъекции ДНК микропипетками и микроманипулятором;

- электропорация – импульсы высочайшего напряжения обратимо наращивают проницаемость биомембран Методы создания рекомбинантных ДНК;

- «мини-клетки», получаемые блокированием донорных клеток в митозе колцемидом. Потом их обрабатывают цитохалазином В и центрифугируют. Образуются микроядра («мини-клетки»), инкапсулированные в цитоплазматическую мембрану. Для их слияния подбирают особые мягенькие условия;

- упаковка в лизосомы – защита экзогенного генетического материала от деяния рестриктаз;

- способ биолистики – один из самых Методы создания рекомбинантных ДНК действенных способов трансформации растений: на частицы вольфрама напыляются ДНК-векторы. Частицы помещаются вовнутрь биолистической пушки, откуда с большой скоростью выбрасываются и, разрывая клеточные стены, входят в цитоплазму и ядро клеток.

С развитием генной инженерии стало вероятным вынудить мельчайшие организмы синтезировать вещества, которые получить другими способами трудно: интерферон, инсулин, соматостатин, фермент Методы создания рекомбинантных ДНК урокиназу, некие причины свертывания крови и др.

Плазмиды можно ввести и в клеточки эукариот. Генетическая трансформация соматических клеток млекопитающих позволяет учить механизмы регуляции экспрессии генов и видоизменять генетический аппарат клеточки.

Генотерапия – исцеления болезней при помощи генов. Существует два типа генотерапии:

- заместительная генотерапия: в клеточку вводят неповрежденный ген;

- корректирующая генотерапия Методы создания рекомбинантных ДНК: дефектный ген подменяют обычным в итоге рекомбинации.

Генотерапию употребляют для корректировки нарушений при прогрессирующей мышечной дистрофии Дюшена (болезнь мальчишек, связанное с недостатком Х-хромосомы): обычный ген, кодирующий белок дистрофии, вкалывают в мышечные волокна, используя или «голую» ДНК, или аденовирусный вектор, и ребенок приобретает способность двигаться. Но пока удалось получить только Методы создания рекомбинантных ДНК временный терапевтический эффект, и потому процедура введения гена должна повторяться не один раз.

Муковисцидоз – наследное болезнь легких, поражающее в Центральной Европе 1-го новорожденного из 2500. Для него установлен дефектный ген, кодирующий белок-регулятор трансмембранной проводимости. Основное проявление этого гена – пневмония. Поражаются все эпителиальные клеточки. Неповрежденную копию гена, включенную Методы создания рекомбинантных ДНК в аденовирусный вектор либо липосому, вводят в форме аэрозоля в дыхательные пути хворого.

Генотерапия применима не только лишь к наследным болезням. Предстоит решить делему исцеления генами СПИДа. ВИЧ – ретровирус, поражающий Т-лимфоциты и макрофаги. Болезнь удалось бы одолеть, если б были найдены новые гены, введение которых в зараженные ВИЧ лимфоциты останавливало Методы создания рекомбинантных ДНК бы предстоящее размножение вируса.

Получение трансгенных животных. Для конфигурации параметров всего организма следует изменять геном половых клеток, которые передадут новые характеристики потомкам. Разработаны методы введения генов в эмбриональные клеточки млекопитающих, мух и неких растений. Микроинъекцию клонированных генов создают в оплодотворенную яйцеклетку, потом ее имплантируют в яйцевод приемной мамы Методы создания рекомбинантных ДНК. Можно вводить ген в сперматозоиды и потом проводить ими оплодотворение.

В Великобритании сделаны трансгенные овцы, молоко которых содержит фактор свертывания крови. Сотворен трансгенный большой рогатый скот, в молоке которого содержится человечий альбумин: любая скотина производит до 80 кг рекомбинантного людского альбумина в год.

Трансгенных животных получают для трансплантации органов. Наилучшие Методы создания рекомбинантных ДНК доноры органов – свиньи, т.к. имеется анатомическое сходство органов и иммунологическийх параметров. Реакции отторжения органов при трансплантации имеют непростой механизм, и одним из сигналов для атаки организма на чужой орган являются белки, локализованные на наружной поверхности мембраны. У трансгенных свиней эти белки изменены на людские.


metodicheskaya-razrabotka-sistema-raboti-uchitelya-defektologa-po-preodoleniyu-trudnostej-stranica-8.html
metodicheskaya-razrabotka-tehnologicheskaya-karta-ee-struktura-cel-i-zadachi-trebovaniya-k-oformleniyu.html
metodicheskaya-razrabotka-temi-nepredelnie-uglevodorodi-alkeni-alkini-alkadieni.html